A . 結核菌挿入断片(IS)6110を用いた分子疫学

古典的な結核症の疫学では、感染伝播に関する研究は対人接触関係や患者の既往といった情報にもっぱら基礎をおいた分析が行われてきました。このため異なる患者からの結核菌株が同一菌株または共通クローンであったとしても、これを明確に決定することは不可能でした。近年、結核菌のゲノム中に存在する比較的安定な遺伝子部分である挿入断片(IS)6110を用い、その可視化結果の違いから分離株の菌種以下の亜分類が可能となりました。このIS6110のゲノム内のコピー数および局在パターンの多様性がこの方法を上の目的のために用いうる有力な手段とするものであり、結核菌株に特異的な技術です。Restriction fragment length polymorphism (RFLP):制限酵素断片長多型分析は一般的に個々の菌株が保有する多形性マーカーのパターンの多様性とその変異を利用する技法です。これまでに多くのマーカーが試されたがIS6110が結核菌群の亜分類には最適です。特に、本邦の様に相互に類似性パターンの多い状況では変異に富むIS6110が推奨しています。実験室的操作と並行して分子疫学で重要なことは複数の患者間の接触状況を解析することです。
IS6110を用いた結核菌の亜分類法は時間の浪費と技術の熟練を要することが最大の欠点です。近年PCR法を基にした方法を用いて日本で発生した集団発生事例で評価した結果、結核菌の亜分類は極めて低いことが判りました。このことは結核が蔓延していた時代のパターンが影響した近年の感染を示しており、ISパターンによるIS6110のバンド数の差異が最も分別能が高かいことが判りました1)

1)結核菌遺伝子型の解析
薬剤耐性獲得や一部の酵素の活性による点突然変異を除き、遺伝子型が同一で有れば表現系も類似すると考えられています。地域の有力株としてEndemicな結核菌株の遺伝子型も流行を維持するリスク因子の一つとして興味が持たれています。その一つが北京遺伝子型で、感染伝播が強く、結核病態も重症であることが判ってきています。また、他の遺伝子型を解析する方法としてIS6110 ,dnaA-dnaN部位のIS6110挿入の有無、あるいはSpoligotypingがあります2,3,4)。種々遺伝子型は世界的な結核菌株の遺伝子型の比較研究プロジェクトであるGlobal characterization5)の中で注目されています。その内の遺伝子型のひとつが北京ファミリー(北京遺伝子型)と呼ばれるものである。北京遺伝子型の結核菌は抗結核薬の静菌作用に対して有意な高頻度の抵抗性であることが示されている6,7,8)。この遺伝子型は1990年代初頭の北アメリカにおけるおおくの多剤耐性結核の院内・施設内感染を引き起こしたW株とよく一致しています。このW株は 北京ファミリーの進化的な分枝といえるものであり、北京遺伝子型と比較するとIS6110のパターンは類似点を持ちIS6110をA1(3.36Kbp)とB2(1.14Kbp)領域内に保有しています3)。さらに、Spoligotypingパターンは特徴のあるスペーサー配列35-43のみを保有するパターンを示すことが知られています4)
国際比較の検討は結核蔓延国での発生頻度が高いことから、そこで発生する多剤耐性結核菌の伝播をグローバルレベルで解析することは重要です。最近の知見では、薬剤耐性菌による伝播が原因となる初回耐性は集団でのINH耐性株が限られたRFLPパターンを伴うことからクラスター分析とINH感受性パターンの相関関係もまた初回耐性と獲得耐性を検査するINH耐性菌のモニタリングに重要な応用であると述べられています9)
各国で分析されたIS6110のコピー数は0から23本の分布が確認され、同時に高蔓延国や中蔓延国のアフリカ、アジアなどではIS6110のRFLPのパターンは低蔓延地域に比べてしばしば有意に多様性が低く、特定のパターンの優勢な菌株の存在が報告されています。例えば、チュニジアでは62%の分離株が65%以上の類似性を有する3つのファミリーに属しており、エチオピアでは52%の分離株が4つのファミリーに属しています10)。低蔓延国のそれは集団発生や院内感染事例が多く、特定パターンの株の多発があるとすればそれははこのためと考えられ、一般には多様性が高いとされています。しかし対照的に、Warrenらは南アフリカのケープタウンでは結核蔓延地域であるにもかかわらず、RFLPのパターンは多様性が高いことを報告しています11)。我々が行った国別の結核菌株の解析でも、国に特異的なISパターンが存在することが判りました。韓国、インド、インドネシア、イエメン、ネパール、タイ、ボリビア、モンゴル、上海株のパターンを示した(図1)。アジア大陸に沿った国々では類似性の高いパターンを示したが、イエメン、インドネシア、ネパール、南米ボリビア株は国ごとに特徴あるパターンが見られました。このこと在日外国人結核の日本への影響のモニタリングにRFLP分析が応用できる可能性を示唆しています。実際に在日外国人の菌株のRFLP解析では
図1 図2
低蔓延国からの外国人結核患者株は日本で検出される菌株に似ており、結核高蔓延国からの外国人結核患者株は在日5年以内のものではそれぞれその国に特有のパターンを示した(図.2)。これらの知見はデンマークでのエスキモー移民からの影響12)、オランダでのソマリア移民13)、米国でのアジア、ヒスパニック、メキシカンの移民の解14,15)での一致と相関しています。




2) IS6110の安定性
IS6110の変異と安定性を検討するため、予防会複十字病院で結核症と診断された結核患者96人からくり返し分離された合計192株を対象として分析した。その結果24組(25%)が一本のバンド付加の変異を示しました。このことは、2人の患者の菌株間にバンド1本くらいの違いがあっても、疫学調査上接触が判明すれば2株は同一菌株由来と考えられることもあることを意味しています。図3は同一患者間でISが転位(欠損および付加を含む)した株の一部を示しました。また、米国の臨床株に関する観察でも90日間で29%の株に何らかの変異が確認されています16)。一方、オランダのグループは、長期間排菌された結核菌で分析した結果、
図3
IS6110の安定性は計算上3.2年に一本のバンドに変異が起こる程度のものであることを解明しました17)。半数の菌株が3-4年で1つのバンドに変化が見られ、この3-4年という時間は、感染から発病までの時間経過からみても、疫学的に関係のある菌株と異なる菌株を区別し、必要な対応をとるのに十分でありIS6110を用いたDNA fingerprintingの結核伝播の疫学研究や対策に対する有用性を支持しています。しかし、前述したように低コピー数のバンドを保有する株はhot-spots領域に保存され非常に安定性が持続することが知られており、スポリゴタイピングや別の挿入配列のような異なる遺伝子マーカーでの分析が必要とされています。

3)M.bovis BCGと結核菌の鑑別
これまで結核予防、膀胱ガン免疫療法で使用されるBCGワクチンのBCG Tokyo株は他のBCGワクチン株であるPasteur、Glaxo、Ticeあるいはもとの牛型菌M.bovisと異なり特徴のある2本バンドを示すことが判りました1)。BCGと結核菌の鑑別はIS6110のみで行われ、何ら不都合は生じませんでしたが、近年、BCG Tokyo株に酷似した結核菌株やBCG Tokyo株のISの変異株が出現してきた。特に結核菌の類似株はアガロースの高分子領域内に1本バンドを保有しており、サザンブロット時に寒天の種類や転写条件の差異によりフィルターに転写し難いこともあると考えられ、注意を要します。これらの菌の鑑別は臨床医学的に重要です。
図4において、レーン1はBCG変異株、レーン2、3は結核菌、レーン4は通常のBCG株のIS6110パターンです。このような問題に対処する方法のひとつとしてMPTR法18)があります(図.5.1)。これは結核菌群のゲノム内に存在するMajor polymorphic tandem repeatの300bpの一部をPCRで増幅後、BanIで消化し、アガロース電気泳動で断片の分子量を測定する方法です。この方法により結核菌群のMPTR領域内PCR産物の長さや変異を示すSequevarのLONG, MED-G, MED-C およびSHORT と呼ばれる4つのタイプに分別でき、特にLONG(PCR産物343bp)は結核菌とM.bovisに見られ、MED-G(PCR産物328 bp)は結核菌とM.bovis の765番目の塩基がGであるのに対し、MED-C(PCR産物328 bp)はM.bovis BCGのみ765番目がCに置換しています。また、SHORT(PCR産物313 bp)はM. africanum で検出される。検体を結核菌とM.bovis BCGにするためのより確実な方法は塩基配列決定により解析を行うことができます。一方、SpoligotypingはM.bovisとBCGのみが39−43のスペーサーを欠如していることを確認します(図.5.2)。これらの併用によってBCGと結核菌、牛型菌野生株などとの鑑別をすることが望ましいと考えています。
図4 図5






B. 16SrRNAとrpoB遺伝子を用いた抗酸菌種の鑑別

抗酸菌検査(Mycobacteriological tests)技術は菌検出や同定に影響するため精度管理(quality control)が必要です。現在まで使用されている従来法(traditional method)による同定は技術的に煩雑で時間を費やすという欠点があります。近年、Mycobacteirum other than M.tuberculosis(MOTT)の中に、traditionalな方法では分離されない菌が検出されてきています。これらの菌種は水、土壌ならびに自然環境中に存在するものが多く含まれていますが、ヒトの病巣より分離される抗酸菌も多数存在します。  
細菌学的分類学(bacterial taxonomy)では抗酸菌の菌種同定もDNAの相同性をもとにすると定義されており、これが70%以上であれば同一菌種であること定義されています。また、ribosome RNA の配列を使った系統発生学( phylogeny )も台頭し、菌種の進化距離を遺伝子配列の違いで推測することができるようになってきています。しかし、16SrRNAの配列が蓄積されてくると、この方法の問題点も明らかになりました。すなわち、1菌種の染色体上のコピーで配列が2%以上異なるケース、あるいは16SrRNAの全ての配列が同じであるのに染色体の定量的DNA/DNAハイブリッドが70%以下であるケースが見つかってきました。Stakebrandt et al. 19)らは“分離株の16SrRNAの全配列を調べて配列が既存の菌種と97%以下であれば独立した種であることは明らかであると記載しています。しかし、98%以上既存の株と類似している場合は類似した菌種と定量的DNA/DNAハイブリッド形成実験を行うべきである”という考えを提唱しています。現在では、この考えに沿ったPCR-based 16S rRNAの塩基配列の多様性による分別する方法が主流です。この定義では97%以上のしきい値(threshold value)で相同性を保有する菌を同一とみなしています。しかし、M.kansasiiM.gastriM.marinumM.ulceransのようにこの方法で分類できない菌種が存在することや、ターゲットの塩基配列(base seqence)が約1500bpであり、一回のシークエンス反応(seqencing)で解析できないと言う欠点がある20,21)。また、heat shock protein(hsp65)22) 、DNA biosynthesis(dnaJ)23)遺伝子内の多様性の変異を基にした分別法が報告されています。 前者はTelenti et al.によりPCR-based hsp65 gene内の制限酵素(restriction enzyme)切断部位の多様性から分別するPCR amplification-restriction analysis(PRA)を開発されました。本法により抗酸菌種全てに共通のprimersを用いることにより得られたPCR productsのrestriction enzyme digestionをアガロースゲル電気泳動(agarose gel electrophoresis)する事により一日で抗酸菌(Mycobacteria)の分別が可能であると報告しています。後者はVictor et.alによりpolymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)を用いて抗酸菌種間の分別を試みています。また、Rothet et al.24)は16-23S rRNA geneの抗酸菌特異的部位(specific region of Mycobacteial species)の増幅(Genus-specific amplification)後、制限酵素を用いたPRAで分別する方法を報告しています。これらの方法も既に評価され、’M.aviumM.paratuberculosisM.silvaticum’および’M.duvaliiM.valentiae’が同種となる不都合が生ずることが報告されている。特にPCR-SSCP法はMOTTからM.tuberculosisのみを分別可能にし、MOTTの菌の分別には適さないことが報告されています。
本邦では核酸(nucleic acid)の相同性(homology)を利用した菌種同定法であるDNA-DNA Hybridization(DDH)25)を用いた迅速同定法が開発され多くの検査室(clinical laboratories)で使用されていますが、本法では分別できない株が存在し精度管理上問題を生じています。最近、Kim et al.によりRNA polymerase β subunit(rpoB)遺伝子内の抗酸菌特異的部位をPRA法で分別し、遺伝子内の多様性の違いから同定する方法が報告されました26)。すなわち、彼らは標準菌44株(reference strains)のrpoBの抗酸菌種間で保存された領域(R454-H554, 306bp)の塩基配列を決定し、簡易鑑別法としてrpoBのPCR産物に対し4種の制限酵素を用いてPRA法により迅速に同定可能な方法を発表しました(J. Clin. Microbiol. 2001)。当所結核菌情報科ではレファレンスラボラトリー(reference laboratory)としての機能拡充を目的として16SrRNAおよびrpoB遺伝子の塩基配列をシーケンサーで(図.6)解析後、16SrRNA系統樹(図.7)とrpoB系統樹を作成して分別能力を確認してデーターベース上で抗酸菌の分別を行っています。本法を用いたM.gordonaeの種内変異が分別可能となり、ヒトに感染性のM.gordonaeの存在が判ってきました27)
図6 図7







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